Tetrahymena thermophila Glutatyon-S-Transferaz Zeta geninin klonlanması, biyoinformatik ve deneysel karakterizasyonu

Abstract

Glutatyon-S-transferaz (GST) enzimleri canlılarda endojen ve ekzojen bileşiklerin detoksifikasyonu sağlarlar. Tetrahymena genom proje sonuçları bu enzim ailesi açısından analiz edildiğinde, 4 alt-grup (theta, omega, mu, zeta) ile temsil edilen 19 farklı GST genine sahip olduğu görülmüştür.. TtGSTz geninin mRNA dizisi (847 bç), genom projesinde bulunan genomik bilgi (77.m00138), EST (Expressed Sequence Tags) dizileri ve 3'RACE deney sonuçlan dikkate alınarak ortaya çıkartılmıştır. TtGSTz geninin başla-dur kodonları arasında kalan protein kodlayıcı 663 bç'lik bölge cDNA olarak klonlanmış dizi analiziyle teyit edilmiştir. GSTz geninin genomik kopyasının klonlanan cDNA ile karşılaştırılması yapıldığında genom projesinde belirtildiği gibi toplamda 122 bç'lik intron içerdiği gösterilmiştir. Klonlanan TtGSTz cDNA'nın kodladığı olası amino asit dizisinden yola çıkılarak yapılan karşılaştırmalı dikey hizalama ile motif analiz sonuçları, zeta alt grubunun karakteristik motifine (SSCX[WH]RVIAL) uygun imza dizisini içerdiğini göstermiştir. TtGSTz'nın hidrojen peroksit ve soğuk (4°C) stresi altında mRNA miktarının zamana bağlı değişimi, yarı-kantitatif RT-PZR yöntemiyle analiz edilmiştir. TtGSTz geninin kodladığı proteinin, E.colide rekombinant protein olarak üretilebilmesi için gerekli olan 7 nokta mutasyonu (TAA > CAA veya TAG > CAG) cDNA üstünde gerçekleştirildikten soma pET16b ekspresyon plazmitine aktarılmış ve E.coli BL21-DE3'de 6X histidin işaretli olarak üretilmiştir. Ni-NTA agaroz ve glutatyon sepharose4B kullanılarak rekombinant 6XHis-TtGSTz proteini (24 kDa) saflaştırılmış ve SDS-PAGE jeli ile üretildiği gösterilmiştir. Saflaştırılan 6xHis-TtGSTz proteinini Western protein analizinde anti-histidin antikoru ile yapılan analiz ile üretildiği teyit edilmiştir.