İnsan serumundan paraoksonaz 1 izoenziminin saflaştırılması ve bazı bitki ekstrelerinin enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi

Abstract

Paraoksonaz 1 (E.C.3.1.8.1; PON1) metabolizmada önemli bir organofosfat hidrolizleyicisi olarak görev yapan ve yapısında 2 adet Ca2+ bulunduran HDL bağımlı bir metaloenzimdir. Enzim HDL'yi oksidasyondan koruduğu gibi LDL'yi de koruyarak aterosklerotik lezyonların oluşumunu engelleyen hayati bir öneme sahiptir. Tez çalışması kapsamında Crataegus tanacetifolia, Rumex acetosella, Thymus sibthorpii ve Asphodeline taurica bitkilerinden hazırlanan ekstrelerin antioksidan özellikleri belirlendi. Bitki ekstrelerinin antioksidan kapasitelerini belirlemek için; demir indirgeme, FRAP, CUPRAC, ABTS, DPPH, DMPD, bipiridil, süperoksit anyon radikali giderme, total fenolik bileşik miktar tayini ve total antioksidan aktivite tayini yöntemleri uygulandı. Aynı zamanda LC/MS-IT-TOF yöntemiyle bitki ekstrelerinin moleküler içeriği tespit edilerek belirlenen etken maddelerle PON1 izoenziminin muhtemel etkileşimleri in silico çalışmalar ile gösterildi. Daha sonra PON1 izoenzimi, insan serumundan sırasıyla, amonyum sülfat çöktürmesi, DEAE-Sephadex A-50 iyon değişim ve Sephadex G-100 jel filtrasyon kromatografisi kullanılarak %5,49 verimle saflaştırıldı. Saflaştırma katsayısı yaklaşık 79,54 ve spesifik aktivitesi 2612,22 EU/mg protein olarak hesaplandı. PON1 izoenziminin saflığı SDS-PAGE yöntemi ile kontrol edilerek alt birim molekül kütlesi 43 kDa olarak belirlendi. Bitki ekstrelerinin enzimin paraoksonaz aktivitesi üzerine in vitro etkileri Aktivite (%) - [Ekstre] grafiklerinde gösterildi. En yüksek aktivite değerini Rumex acetosella bitkisinin etanollü ekstresi, en düşük aktivite değerini ise Asphodeline taurica'nın sulu ekstresi gösterdi. Son olarak kullandığımız bitki ekstrelerinin mitokondriyal aktivite testi (MTT) ile sitotoksisite düzeyleri hesaplandı.