İnsan büyüme hormonu salgılatma sinyal dizisinin Tetrahymena thermophila tarafından rekombinant protein üretiminde kullanımı

Abstract

Tetrahymena thermophila ökaryotik, silli ve tek hücreli bir organizma olup, kısa bölünme süresi ve kolay kültürizasyona sahip bir model organizmadır. Organizmanın rekombinant kapasitesi, insan DNazI enzimi ile insan alkalin fosfataz proteinlerinin rekombinant üretim çalışmaları ile tanımlanmıştır. Günümüzde ilaç sektöründe ihtiyaç duyulan terapötik proteinlerden biri olan ve büyüme bozukluğu olan bireylerin tedavisinde kullanılan insan büyüme hormonunun üretimi maya, E. coli ve insan kücre kültüründe gerçekleştirilmektedir. Daha önce bu proteinin üretiminde kullanılmamış T. thermophila'nın insan büyüme hormonunun E.R sinyal dizisini tanıyarak işleyebileceği ve rekombinant proteini dışarıya salgılayarak üretebileceği çalışmanın hipotezini oluşturmaktadır. Bu amaç doğrultusunda, E.R sinyal dizisi ile birlikte hGH geni dizisinin kodonları organizmaya uyumlu hale getirilerek sentetik olarak ürettirilmiştir. Oluşturulan hGH üretim gen kasetleri, 45 kopyalı genom entegrasyonunu sağlayan pNeo4 ve 10.000 kopyalı ekstrakromozomal dairesel pIGF vektörlerine klonlanarak, biyolistik silah ile konjugatif/vejetatif T. thermophila hücrelerine transforme edilmiştir. Pozitif transformantlar ısı şoku veya CdCI2 ile indüklendikten sonra hücre içi ve hücre dışı ortamdan saflaştırılan proteinlerin iki bağımsız SDS-PAGE ve Western Blot analizi, hücre içi ve hücre dışı ortamda yaklaşık 23 kDa'lık sinyali kesilmiş bir proteinin varlığını göstermiştir. Sonuç olarak; T. thermophila'nın insan hGH'nin E.R. sinyal dizi bölgesini tanıyıp kullandıktan sonra kesip uzaklaştırdığı ve rekombinant proteini hücre dışına salgılayabildiği anlaşılmıştır.