Tetrahymena thermophila'ya kodon uyumu yapılmış superfolder GFP (sfGFP)'nin T. thermophila'da rekombinant protein üretimi ve flüoresan özelliğinin karakterizasyonu

Abstract

Tetrahymena thermophila'da kullanılan, Aequorea victoria Yeşil Flüoresan Proteininin (Wild Type GFP) EGFP gibi değişik mutantları genellikle kodon uyumu yapılmaksızın gen lokalizasyonunda kullanıla gelmiştir. Bu tez çalışmasının amacı; GFP'nin güçlü ışıyan, hızlı katlanan, çözünürlüğü yüksek diğer bir mutant versiyonu olan Super Folder GFP (sfGFP) geninin Tetrahymena'ya kodon uyumu ve afinitik saflaştırmaya uygun hale getirilmesi, rekombinant protein üretimi ve EGFP ile deneysel kullanım açısından karşılaştırmalı karakterizasyonudur. sfGFP geninde % 21.3 sessiz mutasyon ile Tetrahymena'ya kodon uyumu sağlanmış ve N-Terminaline 6XHis takısı (6XHis-TtsfGFP) eklenmiştir. Tetrahymena ifade vektörü olan pVGF'nin PmeI-ApaI kısmına 6XHis-TtsfGFP geni klonlanarak, EGFP yerine yerleştirilmiş ve MTT1-6XHis-TtsfGFP-rp129Ter kaseti oluşturulmuştur. Kontrol grubu olarak Tetrahymena'ya kodon uyumu yapılmamış sfGFP aynı şekilde yapılandırılmıştır. Vektörler elektroporasyon ile konjugatif hücrelere transform edilmiştir. Elde edilen TtsfGFP, sfGFP ve EGFP klonlarının CdCI₂ ile indüksiyonundan sonra ki 3. saatte yapılan in vivo spektroskopik flüoresan ölçümü, TtsfGFP'nin kontrollore göre ~2.2-4 kat fazla ışıma verdiğini göstermiştir. Flüoresan mikroskop analiz bulguları; TtsfGFP'li hücrelerin maksimum görsel ışımaya 100 dk gibi kısa bir sürede ulaşmasına rağmen EGFP ve sfGFP'li hücrelerin ~240 dk'da ulaştığını göstermiştir. pVTtsfGFP vektöründe yer alan 6XHis-TtsfGFP'nin C-terminaline Tetrahymena'nın bir hipotetik geni (H) XhoI-ApaI klonlaması ile yerleştirilmiş ve Tetrahymena thermophila hücresi içinde füzyon proteinin makronükleus ile mikronükleusta lokalize olduğu görülmüştür. TtsfGFP ile TtsfGFP-H'nin Ni-NTA ile afinitiksaflaştırılabilirliği SDS PAGE ve Western blot analizi yapılarak teyit edilmiştir. Araştırma bulguları, 6XHis-TtsfGFP takısının, Tetrahymena proteinlerinin lokalizasyonu ve saflaştırılmasında affinitik flüoresan takı olarak kullanılabileceğini ortaya koymuştur.