Tetrahymena thermophila transformasyonunda kullanılan replikatif plazmidlere tetrahymena kodon uyumlu neomisin direnç geninin aktarımı ve antibiyotik seçiciliği

Abstract

Günümüzde neomisin dirençlilik geni bulunduran replikatif plasmidler ile T. thermophila'ya yapılan konjugant elektroporasyon (CET) verimliliğinin ~%1-11 aralığında olduğu bilinmektedir; ne yazık ki bu verimlilik oranı cDNA ve genomik DNA kütüphanelerini taramak için yeterli sayıda vejetatif (somatik) veya germ-hattı (kalıtsal) üretmeye yeterli gelmemektedir. Bu çalışmanın amacı; CET'in verimliliğinin kodon optimize neomisin direnç geni (neo4) ile C3 ribozomal DNA (rDNA) replikasyon orijini içeren replikatif bir plazmid ile tanımlanmasıdır. Bu çalışma ile 3.8 kb C3 rDNA replikasyon orijini pH4T2 vektöründen üretilmiş ve pNeo4 vektörünün HindIII-SalI kısmına ligasyon ile eklenerek pNeo4-ori vektörü üretilmiştir. Konjugant T. thermophila hücrelerine 15 µg pNeo4-ori'nin elektroporasyonu gerçekleştirilmiştir. Transformant hücreler ~12-24 saatlik bir beklemeden sonra SPP besiyerinde final konsantrasyonu 1 µg/ml olacak şekilde hücrelerin yarısı CdCI₂ indüklenirken, diğer yarısı CdCI₂'sız besiyerinde 7 gün boyunca paromomisin baskısı 100, 300 ve 600 µg/ml olacak şekilde seçilim sağlanmıştır. Sonuç olarak bu çalışma, neo4 kaseti ile C3 orijininin birlikte bulunduran pNeo4-ori vektörünün elektroporasyon ile Tetrahymena'ya transformasyonunda kullanılabileceğini göstermiştir.