Sıcaksu kaynaklarından termofilik filamentli fungusların izolasyonu, tanılanması ve fitaz enzimi üretimlerinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada sıcak su kaynaklarından termofilik filamentli fungusların izolasyonu, morfolojik ve moleküler tekniklerle identifikasyonu ve fitaz enzimi üretimi yeteneklerinin araştırılması amaçlanmıştır. Kütahya ilinde bulunan 12, Afyon ilinde bulunan 4 kaplıcadan 2008 ve 2009 yıllarında birer kere örnekleme yapılmıştır. Bu sıcak su kaynaklarından alınan 47 farklı sıcak su örneğinden yapılmış olan izolasyon işlemleri sonucunda toplam 137 adet fungus izolatı elde edilmiştir. Bu izolatlardan 25 tanesinin termofilik olduğu yapılmış olan sıcaklık testleri ile belirlenmiştir. Termofilik fungus izolatlarının morfolojik ve ITS, 26-28S rDNA'nın D1/D2 bölgelerine dayalı moleküler tanılamaları gerçekleştirilmiştir. Fitaz enzimi tarama çalışmaları ile seçilen Thermomyces lanuginosus kullanılarak katı faz fermentasyon (KFF) yoluyla fitaz enzimi üretimi gerçekleştirilmiştir. Klasik yöntem ve cevap yüzey yönteminin merkezi bileşke tasarımı fitaz üretiminin optimizasyonunda kullanılmıştır. Morfolojik ve moleküler identifikasyonlar sonucunda termofilik fungus izolatlarının Myceliophthora thermophila, Myceliophthora hinnulea, Melanocarpus albomyces, Rhizomucor pusillus, Thermomyces lanuginosus, Humicola grisea, Humicola insolens, Scytalidium thermophilum, Talaromyces thermophilus, Thielavia terrestris ve Malbranchea cinnamomea türlerinin üyeleri olduğu saptanmıştır. Bu tanılama çalışmaları ile Kütahya ve Afyon illerindeki sıcak su kaynaklarındaki termofilik funguslar ilk kez ortaya konmuştur. Fitaz enziminin üretiminde kullanılmış olan optimizasyon stratejisi geleneksel ve istatistiksel yöntemlerin bir kombinasyonunu oluşturmuştur. Maksimum fitaz aktivitesi substrat olarak pirinç kepeğinin kullanılması ile elde edilmiştir. Maksimum enzim aktivitesi elde edilmesini sağlayan parametrelerin optimum seviyeleri %70 nem, 7 gün fermentasyon süresi, %40 inokulum büyüklüğü, 55 ℃ inkübasyon sıcaklığı, 7,5 başlangıç pH, %30 havalandırma alanı, 5 günlük aşı kültür, %1 sükroz, 2,5 mM ZnSO₄ olarak belirlenmiştir. Uygulanan optimizasyon çalışmaları sonucunda fitaz aktivitesinde 10,83 kat artış sağlanmıştır (0,30 - 3,248 U/ml/dk) ve spesifik fitaz aktivitesi 8,97 U/mg olarak belirlenmiştir. SDS-PAGE ile T. lanuginosus fitaz enziminin molekül ağırlığının ~30 kDa oluşturduğu belirlenmiştir ve zimogram analizi bu bandın fitaz enzimine ait olduğunu doğrulamıştır.