Origanum Onites L.'de mitojenler tarafından aktive edilen protein kinaz kinaz (MAPKK) enzim ailesi üyelerinden birinin klonlanması ve enzimatik olarak tanımlanması

Abstract

Origanum onites ülkemizde kültüre alınmış, ticareti en fazla yapılan bitki türüdür. O.onites'ten elde edilen uçucu yağlar ilaç ve kozmetik başta olmak üzere birçok endüstri alanında kullanılmakta, ayrıca yaprakları baharat olarak tüketilmektedir. Bu bitkiden elde edilen uçucu yağ miktarının farklı bölge, iklim ve yıllara göre farklı oranlarda olduğu bilinmektedir. MAPK (Mitojenler tarafından aktive edilen protein kinaz) enzim ailesi, MAPKKK-MAPKK-MAPK şeklinde üçlü kinaz modülünden olusan bir sinyal iletim yoludur ve bitkilerde çevresel faktörlere karsı hücresel cevabın oluşmasında rol oynar. Bu çalışmada O. onites bitkisinde MAPK sinyal yolunda görev alan MAPKK enzim ailesi üyelerinden birinin klonlanması ve karakterize edilmesi amaçlanmıştır. O.onites bitkisinden beş farklı olası MAPKK cDNA'sının orta bölgeleri klonlanarak nükleotid dizileri belirlenmiş ve bunlardan Oo17-MAPKK'nin 5' ve 3' uçları RACE tekniği ile elde edilmiştir. 5' ve 3' uçlarının dizi bilgisi kullanarak tasarlanan spesifik primerlerle yaklaşık 1400bç büyüklüğünde ürün elde edilmiştir. Bu ürün klonlanarak nükleotid dizisi saptanmış, NCBI (National Center for Biotechnology Information) veritabanında MAPKK olduğu gösterilmiştir. Klonlanan cDNA OoMAPKK-1 olarak isimlendirilmiştir. Genin amino asit dizisi belirlenerek MAPKK enzim ailesine özgü motifler ortaya çıkartılmıştır. Yapılan RT-PZR analizleriyle OoMAPKK1 gen ekspresyonunun yaprak ve gövde dokularında var olduğu, kök de dört ayrı deneme yapılmasına rağmen var olmadığı, ayrıca soğuk ve yaralanma stres şartlarında arttığı görülmüştür. Rekombinant OoMAPKK1-MBP füzyon proteini üretmek amacıyla start ve stop kodonları içeren spesifik primerler tasarlanarak yapılan PZR sonucu elde edilen 1059 bç(353 A.A.)'lik ürün, pMAL-p2x ekspresyon plazmitine aktarılarak E.coli'de üretilme deneyi yapılmıştır.