Tetrahymena thermophila katalaz geninin mRNA ifadesinin polimeraz zincir reaksiyonu yöntemiyle çeşitli stresler altında kısmi karakterizasyonu

Abstract

Katalazın (E.C. 1.11.1.6) hidrojen peroksidi su ve moleküler oksijene yüksek hızda yıkımı, enzimin gıda, optik ve tekstil gibi endüstriyel alanlarda kullanımına yol açmıştır. T. thermophila göl, tatlı su ve su birikintilerinde yaşayan sili bir protozoandır. T. thermophila katalaz (TtCAT1) geninin dizisi Tetrahymena Genom Veritabanından elde edilmiştir. TtCAT1p amino asit dizisinin diğer katalazlar ile dikey hizalanması korunmuş katalaz aktif bölge motifinin (FDRERIPERVVHAKGAG), katalaz hem ligandı bağlanma bölgesi motifinin (RLSYPDTH) ve peroksizomal lokalizasyon sinyalinin (SNL) varlığını göstermiştir. Katalaz geninin mRNA'sının farklı stresler altında Northern Blot analizi, 23°C ile 30°C'de varlığını, aç hücrelerde ise yokluğunu göstermiştir. E. coli'de TtCat1p'nin rekombinant protein olarak ifadesi için gerekli 10 farklı nokta mutasyonu PZR yöntemiyle yerleştirilmiş ve DNA dizi analizi ile teyit edilmiştir. Rekombinant proteinin E. coli'de üretilip üretilmediği SDS-PAGE ve Western Blot ile anti-GST onoklonal antikor ile anti-sığır katalaz poliklonal antikorları kullanılarak araştırılmıştır. Glutatyon sefaroz 4B afinite boncukları ile saflaştırılmış rekombinant proteinin DOĞAL-PAGE ile katalaz aktivite testi gerçekleştirilmiş, fakat her iki analiz rekombinant GST-TtCat1p proteinin beklenen büyüklükte üretilemediğini ve üretilen ~60 kDa ve ~28 kDa'luk proteinin ise katalaz aktivitesinin bulunmadığını göstermiştir. Sonuç olarak, katalaz geninin açlık şartlarında mRNA'sının bulunmamasının moleküler kontrol mekanizmasının çalışılması için iyi bir deneysel alt yapı oluşturabileceği ortaya konulmuştur. Biyoteknolojik olarak ise TtCat1p'in değerlendirilebilmesi rekombinant protein üretim deneylerinin tekrarlanmasını gerektirmektedir.