Isolation, screening, partial purification and characterization of halophilic protease from different samples

Abstract

Bu çalışmada, Endonezya fermente tuzlu gıdaları ve tuzlu toprak örneklerinden proteaz üreten bakteriler taranmış ve izole edilmiştir. Bu çalışmanın amacı, halofilik bakterilerin izolasyonu ve daha sonra bunlardan halofilik proteazların taranması, saflaştırılması ve karakterize edilmesidir. Bu çalısmada, Endonezya geleneksel fermente tuzlu gıdaları olan tauco ve terasi'den 4 tane halofilik bakterileri izole edildi. Bu izolatların arasında en iyi proteaz üreten izolat olarak, tauco'dan izole edilen TANN 4 seçildi. Bu izolat % 1 süt tozu ile takviye edilmiş % 18 MGM (Modifiye Geliştirme Medium) broth ve agar besiyerinde geliştirildi. İzolat TANN 4'ten hücre dışı proteaz enzimi, (NH4)2SO4 çöktürmesinden sonra dializ ile kısmi olarak saflaştırıldı. Proteaz enzimi kısmi olarak %72.87 verimle ham homojenata göre 25.41 kat saflaştırıldı. Bu termoaktif ve alkalifilik saflaştırılan proteaz enziminin optimum pH ve sıcaklığı sırasıyla 8.0 ve 50 °C olarak bulundu. Saflaştırılan enzim, %1 'den %15'e kadar olan genis bir tuz konsantrasyon aralığında aktif olarak belirlendi ve optimum tuz konsantrasyonu ise %1 (w/v) olarak bulundu. Enzim aktivitesi etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) spesifik proteaz inhibitörüyle tamamen inhibe olduğu için enzim grubu metalloproteaz olduğu belirlendi. Proteaz enziminin Ca2+, K+ ve Mg2+ gibi metal iyonlarıyla aktive olduğu belirlendi. Saflaştırılan enzimin Km ve Vmak kinetik parametreleri kazein substratı kullanılarak sırasıyla 0.0649 mM ve 216.45 U mg−1 olarak bulundu. Saflaştırılan enzimin molekül ağırlığı sodyum dodesilsülfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS PAGE) ile yaklaşık 19.8 kDa olarak tayin edildi. Enzimin yüzey aktif maddeleri (% 0.1-0.5 SDS ve % 1-5 Triton X-100), %1 OMO ve Ariel deterjanlar ile ve ayrıca % 25 metanol gibi organik çözücülerle kararlılığını koruduğu tespit edildi. Ayrıca, saflastırılan proteaz enziminin en iyi aktiviteyi kazein, sıgır serum albumini (BSA) ve hemoglobin substratlarına karsı gösterdigi görülmüstür. Proteaz üretici izolatlarin identifikasyonu için ribotiplendirme analizi gerçekleştirilmiş ve bu örneklerden 3 (izolat TANN 4, TR 2 ve TR 4) tanesinin sırasıyla % 71, 68 ve 69 % benzerlik oranları ile Halobacillus trueperi) ve 1 tanesinin (izolat TR 1) ise % 64 oranı ile Virgibacillus pantothenticus oldukları tespit edilmiştir. Bu çalışmayı geliştirmek için daha ileri seviyede protein saflaştırma, bakteriyel tanımlama ve besiyerleri optimizasyonu gerekmektedir.