İnsan gen terapötiklerinden interferon beta (hIFNß)'nın Tetrahymena thermophila'da rekombinant üretimi ve karakterizasyonu

Abstract

Sağlık ve Biyoteknoloji araştırmalarında alternatif protein üretim konakçısı olarak kullanılmakta olan silli tekhücreli Tetrahymena thermophila ucuz ve kolay kültüre edilebilmektedir. Anti-kanser monoklonal (rituximab) antikoru, bu organizmada en son üretilen gen törapotiğidir. T. thermophila ürettiği proteinlere disülfit bağları ile insanınkine benzer küçük yapılı glikozilasyon çatalı eklemesiyle E. coli' den farklılaşmaktadır. Multiple Skleroz (MS) oto-immün hastalığının tedavisinde kullanılan insan interferon beta (IFNß) terapötik proteinin T. thermophila'da rekombinant üretimi, bu tez çalışmasının amacını oluşturmaktadır. T. thermophila'ya kodon optimizasyonu gerçekleştirilen hIFNß'nin dizisine, füzyon proteinin C-ucunda sfGFP ve 12xHis afinitik saflaştırma takısı olacak şekilde kodlayıcı diziler eklenerek oluşturulan okuma çerçevesi, kadmiyum ile indüklenen MTT1 promotoru kontrolü altına klonlanmıştır. Floresan mikroskop, SDS-PAGE ve Western blot analizleri, 48 kDa'luk Tt-hIFNß-TtsfGFP-12xHis füzyon proteini ile 20 kDa'luk kırılmış Tt-hIFNß'yı T. thermophila' nın rekombinant protein olarak ürettiğini işaret etmektedir. Afinitik takısız ve GFP'siz hücre dışına salgılatılabilen Tt-hIFNß kodlayıcı dizi ısışoku promotoru altında gen kaseti olarak TtAC2 yapay kromozom vektörüne klonlanmıştır. Transformasyon ve antibiyotik seleksiyonu ile pozitif tek hücre klon izolasyonu gerçekleştirilmiş ve protein saflaştırma ile aktivite analizlerine geçilmiştir.